重组腺病毒-慢病毒构建包装服务
为促进国内相关领域的研究进展,上海闪晶分子生物有限公司从2008年开始,对国内实验室开展重组腺病毒/慢病毒构建、包装及扩增服务,可以由客户提供自己的基因,完成腺病毒/慢病毒构建、鉴定、包装的服务。我们的宗旨是:“专业公司,打造专业服务!”,过表达慢病毒包装纯化只要4500.00/ml,大于10的8次方滴度。
一、技术路线:
(一)A、腺病毒载体构建:
本系统是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA为骨架,在克隆、包装、扩增等各部条件做了改进和优化,达到了克隆阳性率更高、质量更可靠、包装稳定、出毒迅速、滴度高等效果。在此基础上,还拓展了更广泛的应用,可以提供各种带报告基因的,带不同标签的腺病毒构建和包装服务。所包装的腺病毒已成功应用于信号转导,基因转位,Co-IP,动物实验,干细胞研究等科研实验。并且可以完成较高难度的克隆构建,包括具有细胞毒性作用基因的腺病毒构建,在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。
根据客户提供的原始质粒信息确定克隆方案:
- 如果原始质粒与本系统所用穿梭载体有匹配酶切位点,采用相应的内切酶切下相应片断,回收并连接到穿梭载体。酶切,测序鉴定;
- 如果原始质粒与本系统所用穿梭载体没有匹配酶切位点,设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增,得到目的片断,采用相应的内切酶切下相应片断,回收并连接到穿梭载体。酶切,测序鉴定;
- 对于不适用于以上方案或者有特定要求的样品,与客户协商定制具体实施方案
2)克隆目的基因到腺病毒载体pAdPL及鉴定
利用重组技术将目的片段的表达框从穿梭载体转移到腺病毒载体。
酶切鉴定阳性克隆,将阳性克隆测序二次鉴定。
B、慢病毒载体构建
慢病毒(Lent virus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体,该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,达到持久性表达的效果。可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景。
(二)病毒包装、扩增:
- 将鉴定正确的基因克隆到慢病毒载体,与辅助载体一起转染293T细胞进行包装;
- 将包装好的病毒超速离心收集;
- 将浓缩病毒进行滴定,滴定结果单位为PFU/ml(一般为5×108 PFU/ml以上,体积为500μl以上,根据客户需要,不同量有价格差异),慢病毒包装4500.00/ml过表达,2500.00/ml干扰
二、质量控制与鉴定:
- 测序鉴定
- 根据特定引物作RT-PCR鉴定
- 蛋白表达鉴定(根据客户要求并由客户提供高特异性抗体)
三、客户须知:
对于客户所要构建腺病毒的目的基因,客户须提供详细的基因相关信息,包括基因序列,载体序列,载体图谱。
载体构建步骤所需时间,根据不同构建方案,需15到25个工作日。
从合同签订之日起,客户需交纳首期技术服务费(50%服务费),方可进行实验。服务结束时一次结清余款。
客户需提供的信息及材料:
- 插入目的片段序列信息,原始载体序列信息,载体图谱,酶切分析图等。
- 鉴定正确的原始质粒,PCR引物及PCR鉴定方法说明(包括PCR体系及PCR条件)(非必需,或需协商),测序引物(非必需,或需协商)。
- 原始质粒的酶切鉴定报告、测序报告,如果客户确定基因的信息无误,这条非必需。
- 实验目的、要求,目的基因有无细胞毒性,是否需要构建对照病毒?
- 实验要求包括:是否自行构建腺病毒载体?是否要求更换启动子、polyA等基因元件?
- 实验目的包括:用于细胞实验还是动物实验,需要感染的细胞类型或动物模型类型。
四、我们的承诺:
- 构建腺病毒/慢病毒载体的时间约15到25个工作日。病毒的包装,扩增的时间约20到30个工作日。总计需要45-55个工作日。
- 提供重组穿梭载体或者siRNA载体,重组腺病毒载体的酶切及测序报告。
- 免费提供一管阴性对照(仅限通用型的,如果客户指定的序列,需要另外计费)。
- 最大插入片段5kb-8Kb。
补充说明:
- 如果客户需更换启动子,需保证所插入的基因的表达产物对细胞无毒害作用,
- 如果插入的目的片段太长,客户要求测序验证全长,需要提供基因的特异引物,以测得全长,加收一定的费用。
五、腺病毒包装和慢病毒包装比较表
腺病毒载体系统和慢病毒载体系统比较 |
病毒表达系统 |
腺病毒表达系统(Adenovirus) |
慢病毒表达系统(Lentivirus) |
病毒基因组 |
双链DNA病毒 |
RNA病毒 |
复制 |
自主复制 |
自主复制 |
是否整合 |
病毒基因组游离于宿主基因组外,瞬时表达外源基因 |
病毒基因组整合于宿主基因组,长时间、稳定表达外源基因 |
感染细胞类型 |
感染分裂和不分裂细胞 |
感染分裂和不分裂细胞,适合难转染的原代细胞(如神经细胞,淋巴细胞)及体内实验 |
表达丰度 |
高水平表达 |
中水平表达 |
表达时间 |
快(1-2 天) |
慢 ( 1-3天 ) |
滴度 |
滴度高达1011pfu/ml |
滴度最高可达108 pfU/ml |
克隆容量 |
可插入高达8kb的外源片段,滴度随插入片段长度增加而降低 |
可插入不超过8kb的外源片段,滴度随插入片段长度增加而降低 |
免疫原性 |
高免疫原性 |
低免疫原性 |
联系电话:021-54460832 Email:master@shinegene.org.cn QQ:896197990
细胞培养 |